Activité antimycobacteriennes des extraits d’une plante médicinale togolaise Acanthospermum Hispidum sur Mycobacterium Smegmatis et Mycobacterium Aurum

  • par Urbain AMOUSSOU
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  • 2014-06-20 14:16:13
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ACTIVITE ANTIMYCOBACTERIENNES DES EXTRAITS D’UNE PLANTE MEDICINALE TOGOLAISE ACANTHOSPERMUM HISPIDUM SUR MYCOBACTERIUM SMEGMATIS ET MYCOBACTERIUM AURUM

 

Laboratoire de Biotechnologie Microbienne, Faculté des Sciences et Techniques (FST) de Fès, Université Sidi-Mohammed-Ben-Abdellah, route d’Immouzer, BP 2202, 30000 Fès, Maroc

Institut National des Plantes Médicinales et Aromatiques, Taounate, Maroc.

Laboratoire de Botanique et Ecologie Végétale, Faculté des Sciences, Université de Lomé au Togo.

 

Résumé:

Acanthospermum hispidum est une espèce de la famille des Asteraceae, très répandue dans la sous-région ouest africaine. Elle est connue pour son importance thérapeutique. Dans ce travail, l’activité antimycobactérienne de cette espèce a été évaluée par la méthode des disques. Différents extraits ont été obtenus par extraction au soxhlet, avec une activité avérée pour l’extrait à l’acétate d’éthyle, qui a ensuite été fractionné par chromatographie sur couche mince. Les fractions responsables de l’activité observée ont été identifiées après fractionnement des extraits et couverture de la plaque chromatographique par une culture liquide de Mycobactérium smegmatis. Les tests phytochimiques réalisés ont montré que les molécules responsables de l’activité antimycobactérienne sont des polyphénols, des tanins et des flavonoïdes.

Mots-clés: acanthospermum hispidum, antibiotiques, mycobactéries

Abstract:

Acanthospermum hispidum is a species of the Asteraceae family, widespread in the West African sub-region. It is known for its therapeutic importance. In this work, the antimycobacterial activity of this species was evaluated by the disc method. Different samples were obtained by Soxhlet extraction with an extract for the activity proved to ethyl acetate, which was then fractionated by thi, layer chromatography (TLC). Fractions responsible for the observed activity were identified after fractionation of extracts and coverage of the chromatographic plate by a liquid culture of Mycobacterium smegmatis. Phytochemical tests showed that the molecules responsible for the antimycobacterial activity are polyphenols, tannins and flavonoids.

Key-words: Cymbopogon winterianus, antibiotics, mycobacteria

 

  1. INTRODUCTION

La tuberculose est l’une des principales maladies infectieuses, responsable de décès, de souffrances et d’appauvrissement. L’ampleur de l’épidémie mondiale de tuberculose exige une action urgente et efficace. Le taux d’incidence de la tuberculose continue à croître de 1 % par an au niveau mondial. Malgré les traitements efficaces et peu coûteux dont on dispose actuellement, on continue à dénombrer annuellement dans le monde 9 millions de nouveaux cas de tuberculose et près de 2 millions de décès dus à la maladie, ce qui constitue un fardeau intolérable de souffrance humaine et un obstacle au développement socioéconomique.

Elle touche des millions de personnes. Environ un tiers de la population mondiale est atteinte de tuberculose, c’est-à- dire souffre d’une infection latente et court donc le risque de contracter ultérieurement la maladie. Dès 1993 l’Organisation mondiale de la Santé a déclaré la tuberculose une urgence mondiale » (Organisation mondiale de la Santé, Plan mondial Halte à la tuberculose 2006–2015).

De plus, l’émergence chez ce pathogène de souches résistantes aux antituberculeux classiques, assombrit sérieusement le pronostic des patients tuberculeux, et pose un réel problème de santé publique (Wladimir Sougakoff  et al 2008).

Face à cette situation, il est urgent d’intensifier les efforts de recherche visant à caractériser de nouvelles cibles et molécules antituberculeuses.

Les autres mycobactéries appelées mycobactéries atypiques ou non-tuberculeuses sont omniprésentes dans l’environnement. Dans certaines circonstances (immunodépression, lésions, maladies préexistantes…) certaines peuvent devenir pathogènes pour l’homme, on parle d’infection opportuniste ou mycobactérionse (Jonsson et al., 2007).

Notre travail porte sur l’isolement et la caractérisation de nouvelles molécules, anti-mycobactériennes à partir de plantes médicinales. Les extraits des plantes, contenant les molécules recherchées, ont été testés sur Mycobactérium aurum et Mycobactérium smegmatis, deux mycobactéries dont la structure est proche de celle de Mycobactérium tuberculosis. Cette étude a été ensuite suivie d’une analyse chromatographique qui a permis de séparer et d’identifier des molécules responsables de l’activité antimycobactérienne.

A notre connaissance aucune étude  de ce genre n’a jamais été réalisée en vue de connaître l’effet sur les mycobactéries des extraits de Acanthospermum hispidum.

  1. MATERIEL ET METHODES

2.1.Matériel végétal

       Acanthospermum hispidum est une herbe suffrutescente annuelle à tige poilue, parfois vivace, formant des petits buissons de 50 cm de haut ou plus, très ramifié à cime en boule étalée. Les feuilles de 4,5 cm sur 2 cm, sont sessiles, ovales, obtuses ou courtement et largement acuminées au sommet. Les inflorescences axillaires, solitaires et sessiles, sont formées de plusieurs fleurs jaune-pâles. Son fruit est composé de cinq akènes rayonnant terminés par un crochet épineux (Kerharo et Adams, 1974; Burkill, 1985 et Dokosi, 1998).

 

Les échantillons de Acanthospermum hispidum, ont été prélevés au Togo, à Lomé. La récolte a été effectuée en Septembre 2010. Les plantes entières ont été séchées à l’air libre, à l’abri du soleil. Elles ont été ensuite broyées pour la préparation des différents extraits.

2.2.Souches mycobactériennes utilisées

Les souches bactériennes utilisées dans ce travail sont :

-          Mycobactérium smegmatis : bacille de 3 à 5 µm de long, du phylum des Actinobacteria. Cette espèce partage plusieurs homologies avec M. tuberculosis et présente une sensibilité aux antiyuberculeux similaire à celle de M. tuberculosis. Cette mycobactérie est non pathogène et possède un temps de génération d’environ 3h. De ce fait, M. smegmatis est très utilisé pour étudier les mycobactéries.

-          Mycobatérium aurum : Mycobacterium aurum est également une espèce non pathogène à croissance rapide, avec un temps de génération de 6 h. l’inhibition de sa croissance est hautement prédictive de l’activité contre M. tuberculosis.

Le milieu de culture utilisé pour les souches bactériennes est le milieu Luria-Bertoni (LB), à 37°C.

2.3.Extraction par solvants utilisée

Extraction avec des solvants à polarité croissante par soxhlet:

Un extracteur de Soxhlet est une pièce en verre très utilisée comme technique conventionnelle d’extraction. Il est spécialement conçu par Franz von Soxhlet, pour l'extraction continue solide liquide. Il a été souvent considéré comme une méthode de référence. Quand le ballon est chauffé, les vapeurs du solvant passent par le tube adducteur, se condensent dans le réfrigérant et retombent dans le corps de l'extracteur, faisant ainsi macérer le solide (matière végétale) dans le solvant (chauffé par les vapeurs se trouvant en dessous). Le solvant condensé s'accumule dans l'extracteur jusqu'à atteindre le sommet du tube-siphon, ce qui provoque alors le retour du liquide dans le ballon, accompagné des substances extraites, et le solvant contenu dans le ballon, s'enrichit donc progressivement en composés solubles. Le contact entre le solvant et le produit à extraire dure pendant l'accumulation de solvant dans le réservoir où se situe la cartouche, puis quand le solvant atteint un certain niveau, il amorce le siphon et retourne dans le ballon en entraînant les substances dissoutes. Ce cycle peut être répété plusieurs fois, selon la facilité avec laquelle le produit diffuse dans le solvant.

Les extractions ont été réalisées avec un système de quatre solvants à polarité croissante :

-        Hexane permettant d’extraire en général les lipides des plantes

-         acétate d’éthyle permet d’extraire certains flavonoïdes et les composés les moins polaires

-         dichlorométhane pour l’extraction des composés plus polaires

-        Et enfin le méthanol pour toutes les autres molécules

Calcul des rendements

La formule suivante nous a permis de calculer les rendements des extractions.

Rdt= (EB/MS) x 100

Avec : Rdt= Rendement ; EB= Extrait brut obtenu après l’extraction ; MS = Masse de matière sèche à partir de laquelle l’extraction a été réalisée.

 

2.4.Fractionnement des extraits par chromatographie sur couche mince (CCM)

2.4.1.      Principe de la Chromatographie sur couche mince (CPG)

La CCM est une méthode à la fois physico-chimique et analytique qui permet de séparer les différents constituants d’un extrait.

Dans la CCM, l’adsorbant est constitué d’une couche mince et uniforme, environ 0,25 mm d’épaisseur, appliquée sur un support approprié comme une plaque de verre ou une feuille d’aluminium ou de plastique. Dans notre cas, nous avons utilisé la feuille d’aluminium.

On laisse la phase mobile se propager à la surface de la plaque par capillarité. Au cours du processus chromatographique, la plaque est placée dans une cuve à chromatographie en verre dans laquelle l’atmosphère est habituellement saturée de vapeur de solvants.

Comme support solide on utilise souvent un gel de silice, de l’alumine ou de la cellulose.

La CCM permet, non seulement, de vérifier l’efficacité des extractions avec plusieurs solvants, mais aussi de pouvoir identifier les différentes fractions et constituants obtenus au cours des séparations.

Technique

a) Solution à analyser

Nous avons dissout 20 mg de chaque extrait dans 80 µl d’acétate d’éthyle.

b) Dépôt

Les dépôts ont été faits avec une micropipette sur une plaque de CCM en aluminium. 10 μl de chaque extrait ont été déposé sur la plaque.

c) Migration

La migration se fait dans un système de solvants approprié pour chaque extrait.

Nous avons ensuite calculé pour chaque tâche le coefficient de migration ou rapport frontal (Rf):

Rf = Distance parcourue par la substance / Distance parcourue par le solvant

2.4.2.      Identification des bandes actives

Après fractionnement des extraits par CCM, une culture de M. smegmatis est ensuite coulée sur la plaque de chromatographie puis incubée à 37°C pendant 24 h.  Les zones d’inhibition obtenues sont ensuite grattées, éluées dans le solvant d’extraction correspondant et centrifugées. Le surnageant est ensuite récupéré, concentré par évaporation, puis le concentré est testé par méthode de disque pour confirmer la présence effective des molécules inhibitrices.

2.5.Tests phytochimiques

Les tests phytochimiques ont porté sur la révélation et le dosage de quelques composants majeurs des extraits végétaux, pouvant être responsables des activités, tels que les tanins, les flavonoïdes, les alcaloïdes et les polyphénols totaux.

Tanins

Nous avons introduit dans un tube 5 ml d’extrait dilué à 5% dans le solvant d’extraction et 1ml de solution aqueuse de FeCl3 à 1%.

Le développement d’une coloration verdâtre ou bleu noirâtre indique la présence de tanins.

Les flavonoïdes libres

Nous avons introduit dans un tube à essai 5 ml d’extrait à 5%,  5 ml d’alcool chlorhydrique, quelques copeaux de zinc et 1 ml d’alcool isoamylique : c’est la réaction de la Cyanidine.

L’apparition d’une coloration :

- rose orangée indique la présence de flavones

- rose violacée caractérise les flavanones

- rouge indique la présence de flavonols et de flavanonols.

Les alcaloïdes

Pour mettre en évidence la présence d’alcaloïdes, le réactif de Dragendorff est pulvérisé directement sur la plaque CCM. La présence d’alcaloïdes est révélée par l’apparition d’une coloration orangée vive.

Les polyphénols totaux

On réalise une gamme étalon en milieu aqueux avec un polyphénol témoin, en général de l’acide gallique. Pour réaliser le dosage, 100 μL de réactif de Folin-Ciocalteu (Sigma, dilué 10 fois dans de l’eau ultra pure) sont ajoutés à 20 μL d’extrait dilué à 1 mg/ml. On ajoute ensuite 300 μL de Na2CO3 (75 g.L-1). Le mélange est agité, puis incubé 5 min à 40°C, et la densité optique est mesurée à 735nm.

2.6.Evaluation de l’activité antimycobactérienne

La méthode des disques

Les extraits des plantes ont été testés sur les souches mycobactériennes par la méthode des disques. C’est la méthode de diffusion sur gélose la plus utilisée par les laboratoires.

Principe général

Elle consiste à ensemencer, en surface d'un milieu solide par inondation, les souches bactériennes à tester. Après dépôt d’un disque en papier buvard, on ajoute l’antibiotique et on laisse diffuser. L’antibiotique diffuse à partir du disque en créant un gradient de concentration. La détermination du diamètre de la zone d’inhibition permet une estimation de la concentration minimale inhibitrice (CMI). Les caractères de sensibilité ou de résistance de la souche bactérienne en seront déduits.

Technique

On étale 100 µl d’une culture de M. smegmatis ou M. aurum (titre : environ 106 UFC/ml) sur le milieu LB-agar. On applique des disques à l’aide d’une pince stérile, en les posant à environ 2 cm de la périphérie de la boîte, tout en appuyant légèrement afin d’assurer le contact avec le milieu de culture. A l’aide d’une micropipette, un volume de 20 µl de l’extrait est déposé sur le disque et on laisse la boîte 30 minutes sur la paillasse.

La boite ainsi préparée est incubée  pendant une nuit à 37°C. Après incubation, les disques s'entourent de zones d'inhibition circulaires correspondant à une absence de culture.

Pour chaque extrait, un minimum de trois répétitions ont été effectuées pour tester l’activité antymycobactérienne par la méthode des disques.

  1. RESULTATS ET DISCUSSION

3.1.Préparation des extraits de Acanthospermum hispidum

109 g de feuilles de Acanthospermum hispidum ont été traitées avec différents solvants par soxhlet. Les résultats sont présentés dans le tableau suivant :

 

Tableau 1 : Rendements des extractions par différents solvants

Rendement en extraits

Hexane

Acétate d’éthyle

dichlorométhane

méthanol

2,87%

6,42%

0,14%

2,6%

 

On peut noter que le meilleur rendement est obtenu avec l’acétate d’éthyle, avec un pourcentage de 6,42%. Ceci peut être attribué au fait que la grande majorité des composés de cette plante sont solubles dans l’acétate d’éthyle.

3.2.Activité antimycobactérienne

Les résultats de l’activité des extraits de Acanthospermum hispidum sur les souches bactériennes sont montrés dans le tableau 2 suivant :

Tableau 2 : Effet des extraits de Acanthospermum hispidum sur les souches mycobactériennes

Diamètre d’inhibition (cm)

Extraits

Hexane

Acétate d’éthyle

Dichlorométhane

Méthanol

M. smegmatis

0,1

2,5

0,5

0,4

Témoin

0,2

0,1

0,4

0,5

M. aurum

0

2,7

2,4

0,4

Témoin

0

0,7

0,1

0,5

 

L’extrait à l’acétate d’éthyle a donné le meilleur résultat avec une zone d’inhibition moyenne de 2,5 cm pour M. smegmatis et de 2,7 cm pour M. aurum. Ceci montre que les molécules responsables de l’activité sont plus extractibles par l’acétate d’éthyle que par les autres solvants. L’extrait à l’acétate de cette plante a donc été retenu pour la suite des tests.

 

3.3.Fractionnement des extraits

Plusieurs systèmes de solvants de séparation ont été testés pour le fractionnement de l’extrait de Acanthospermum hispidum. Les résultats de ces tests sont décrits dans le tableau 3 qui suit :

Tableau 3 : Résultats des différents systèmes de fractionnement

Système de fractionnement

Hexane- Acétate d’éthyle (3 :7)

Hexane- Acétate d’éthyle (4 :6)

Hexane- Acétate d’éthyle (5 :5)

Butanol-Acétate- Eau (60-15-25)

Hexane- Acétate d’éthyle (7 :3)

Résultat

_

_

_

_

+

+ : Fractionnement ; - : Absence de  fractionnement

Le système de solvant Hexane-Acétate (7 : 3) fut celui qui a donné le meilleur fractionnement. Les résultats, obtenus après avoir coulé le milieu de culture sur la plaque, montrent qu’effectivement il y’a possibilité de séparer les constituants de la plante en plusieurs fractions actives.

Ces différentes fractions ont été grattées, concentrées comme décrit précédemment et déposées sur disque. Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau 4 suivant :

Tableau 4 : Evaluation de l’effet après fractionnment de Acanthospermum hispidum sur M. smegmatis

Fractions

Rf

Diamètre d’inhibition (cm) après purification

AH1

0,19

1,5

AH5

0,57

2,5

AH 7

0,80

0

 

Le système de séparation Hexane-Acétate (7 :3) a permis d’obtenir deux fractions actives AH1 et AH5, de Rf respectifs 0,19 et 0,57. La bande AH5 est celle qui a donné le meilleur résultat avec un diamètre d’inhibition de 2,5 cm sur M. smegmatis. La fraction AH7, prise comme témoin, est inactive sur les mycobactéries.

3.4.Résultats des tests phytochimiques

Le tableau 5 suivant montre les résultats des différents tests phytochimiques.

Tableau 5 : Tests de révélation phytochimique réalisés sur l’extrait de Acanthospermum hispidum

Extrait

Flavonoïdes

Tanins

Alacaloïdes

Polyphénols totaux

Brut

+

+

_

+

AH1

+

NR

NR

NR

AH5

_

NR

NR

NR

NR : Non Réalisé ; + : Présence du produit ; - : Absence du produit

Au niveau de l’extrait brut de Acanthospermum hispidum, nous avons révélé la présence de flavonoïdes (les flavonones), de tanins et de polyphénols. Par contre, cet extrait ne contient pas d’alcaloïdes.

La fraction AH1 est constituée de flavonoïdes, ce qui suggère que l’effet antimycobactérien de cette fraction est dû aux flavonoïdes.

La fraction AH5 est dépourvue de flavonoïdes, ce qui montre que cette fraction agit sur les mycobactéries par d’autres types de molécules.

  1. 4.      CONCLUSION  

Cette étude a pour but d’évaluer l’activité antimycobactérienne de différents extraits de Ancanthospermum hispidum, une plante commune au Togo, en Afrique de l’ouest.

Les extraits, obtenus par extraction à solvants croissants, par soxhlet, ont permis de mettre en évidence une importante activité antimycobactérienne de l’extrait à l’acétate d’éthyle, contre des souches pures de M. smegamtis et M. aurum, deux mycobactéries non pathogènes dont les structures sont proches de celles de mycobactéries pathogènes comme M. tuberculosis.

 Après fractionnement par chromatographie sur couche mince (CCM), deux fractions actives, qui ont été testées comme étant riche en polyphénols, tanins et flavonoïdes, permettent de supposer que l’activité antimycobactérienne observée est due à ces grands groupes de composés chimiques.

Les résultats obtenus permettent de suggérer l’utilisation de l’extrait à l’acétate d’éthyle de A. hispidum dans la formulation de divers produits qui pourraient avoir un effet inhibiteur sur M. tuberculosis.   

 

Références

Burkill (1985) The Useful Plants of West Tropical Africa – Vol 1, Families A-D – Ed Royal Botanic Gardens, 960p.

Dokosi (1998) Herbs of Ghana; Ghnana universities press, Accra.

Jonsson, B. E., M. Gilljam, A. Lindblad, M. Ridell, A. E. Wold & C. Welinder-Olsson,(2007) Molecular epidemiology of Mycobacterium abscessus, with focus on cystic fibrosis. J Clin Microbiol 45: 1497-1504.

Kerharo J. et Adams J.G. (1974) : La pharmacopée sénégalaise traditionnelle : plante médicinales et toxiques. Edition Vigot et Frères, Paris, 1011p.

Wladimir Sougakoff ,Brossier F, Veziris N, Truffot-Pernot C, Jarlier V, (2008) Molecula investigation of resistance to the antituberculous drug ethionamide in multidrug-resistan clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 

 

Modérateur

  • Florent Breuil

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  • Dernière modération le 23/06/2014 - 14:51

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